NSMB | 从药理、结构到配体发现：血清素5A亚型受体的系统研究
撰文︱张世成
责编︱王思珍
编辑︱杨彬伟
庞大的G蛋白偶联受体（GPCR）超家族是大约35%已知药物的主要靶标，然而这些药物却集中在其中不到10%的受体蛋白上。因此，为进一步发掘基因组中的可成药靶点，美国国立卫生研究院（NIH）在2014年启动了名为IDG (Illuminating the Druggable Genome，https://commonfund.nih.gov/idg,https://druggablegenome.net/)的科学计划，对人类基因组中的激酶，离子通道和GPCR家族中缺乏研究的蛋白进行重点探索研究。其中北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC-CH）的Bryan L. Roth和加州大学旧金山分校（UCSF）的Brian K. Shoichet教授主要负责其中的GPCR领域。血清素（五羟色胺，5-HT）是人体中一种非常重要的神经递质，其紊乱失调会造成抑郁、焦虑、精神分裂症、偏头痛等众多神经精神疾病。血清素受体家族是一个具有7个亚家族，14种亚型的庞大受体家族（人类中为13种亚型, 5-HT5B亚型在人类基因组中提前终止表达）。其中，由于缺少选择性配体（包括拮抗剂和激动剂），5-HT5A亚型是家族中最缺乏研究的受体之一。然而，其有限的功能研究仍显示了该亚型受体与精神异常，抑郁等症状的具有较高的相关性[1]。
早在世纪之初，包括GSK，Roche在内的各大药厂即对其开展了大规模的药物筛选及相关构效优化（Structure-activity relationship，SAR），得到了包括目前仍被广泛用于5-HT5A功能研究的拮抗剂SB-699551等在内的若干配体化合物。2014年，日本的安斯泰来制药公司(Astellas Pharma)筛选得到了具有治疗精神疾病和痴呆等优秀临床前测试表现的ASP5736系列化合物，其中类似物AS2674723对于人源5-HT5A受体的亲和力达到了亚纳摩尔级别[2-4]。今年，通过与UCSF的Brian K. Shoichet教授合作，基于5-HT5A的同源建模结构，Bryan Roth实验室开发了一个具有较好亲和力，但仍结合若干其他血清素亚型受体的小分子化合物UCSF678 [5]。由于脑内各亚型受体表达的空间重叠等因素，发展具有高亲和力的亚型选择性配体对于探知5-HT5A受体的体内功能尤为重要。然而，以上化合物或在小鼠中对于5-HT5A受体亲和力较低，或对于5-HT5A亚型的选择性较差。基于此，课题立意于发展针对5-HT5A亚型受体的高亲和力并具有亚型选择性的配体化合物。
2022年7月14日，UNC的Bryan L. Roth和Jonathan F. Fay实验室合作在Nature Structural & Molecular Biology杂志发表了题为“Inactive and active state structures template selective tools for the human 5-HT5A receptor”的研究论文。在该课题中，作者以开发高亲和力的亚型选择性配体为目标，从药理研究出发，结合结构生物学，药物化学和计算生物学，较为系统地对血清素受体家族中缺乏研究的5-HT5A受体进行了探索研究：包括药理学分析，非激活态和激活态的高分辨率受体结构的测定，以及高亲和力的亚型选择性配体化合物的优化开发。
由于除了血清素（5-HT）及其类似物5-CT，5-HT5A受体的激动剂研究十分有限。因此，作者首先测试了已报道的其他血清素受体的激动剂对于5-HT5A亚型受体的激活能力，发现两种精神类疾病药物，甲基麦角新碱（Methylergometrine）和麦角乙脲（Lisuride），分别为5A受体的完全激动剂和部分激动剂（full or partial agonist）（图1）。此外，作者通过实验室开发的TruPath平台[6]，对于介导5A亚型受体的下游信号的G蛋白亚型也进行了分析，发现除了Gi/o家族外，5-HT5A受体还可以偶联Gq家族的G15蛋白。以上发现进一步丰富了对于5-HT5A亚型受体的药理作用认识。
随后，基于大量生化水平的优化工作，并借助脂立相结晶（Lipid cubic phase, LCP）和单分子冷冻电镜（Single particle cryo-EM）技术，作者成功测定了包括非激活态5-HT5A结合拮抗剂AS2674723，激活态的5-HT5A结合部分激动剂Lisuride，完全激动剂5-CT（吲哚环骨架，indole）和Methylergometrine（麦角灵骨架，ergoline）在内的四个2.8埃左右的高分辨复合物结构。得益于全状态的结构信息，作者分析验证了AS2674723和5-CT的选择性识别模式，讨论了Lisuride的部分激动机制，以及相对于其他血清素受体，5-HT5A亚型受体的整体结构，偶联G蛋白方式及受体激活变化等特征（详见文章内容）。其中，拮抗剂AS2674723除了占据经典的正位结合口袋（Orthosteric binding pocket，OBP）以外，其带有正电荷胍基（Guanidine group）和三氟取代苯环（trifluoro-phenyl ring）还分别占据了位于OBP侧方和上方的扩展结合口袋（Extended binding pocket，EBP）。通过进一步的序列比对和突变体亲和力分析，作者鉴定出氨基酸L7x38和E2x64对于该化合物特异性识别5-HT5A受体具有重要作用。由于二者在同家族的5-HT7亚型受体中同样保守，因而也使得5-HT7受体成为该化合物的主要脱靶受体（图2）。此外，作者还根据结构信息，发现并验证了TM5（Transmembrane helix 5）螺旋上的一组双点突变可以大大降低5-HT5A亚型受体激活的能量壁垒。该发现可用于提高大规模药物筛选的灵敏度，有效促进先导化合物的发现。
图1 5-HT5A亚型受体的配体激活和结合模式
（图源：Roth实验室）
在以上结构信息的基础上，作者同时采用了多种策略进行配体化合物的开发，力求获得针对5-HT5A亚型的选择性拮抗剂，选择性激动剂以及区别于吲哚环或麦角灵骨架的具有新化学骨架构型（new chemotype）的配体化合物。其中，针对非激活态和激活态受体的超大规模虚拟筛选及后续的药理分析均已获得良好结果，该部分仍在整理当中。在本文中，作者以先前已报导的并具有优秀临床前表现的ASP5736及用于结晶的AS2674723化合物为起始化合物，针对其主要的六个脱靶受体进行了选择性优化，以期获得针对5-HT5A亚型受体的高亲和力和选择性的配体化合物。通过分析与5-HT7受体差异性氨基酸的三维分布，作者发现5-HT5A与5-HT7亚型受体的结合口袋高度相似，差异化的氨基酸均位于结合口袋的上方区域。因此，结合上述AS2674723与5-HT5A受体识别模式的分析，作者保留了对于化合物特异性识别重要的胍基，而主要对于占据OBP和EBP2中的官能团进行了构效优化。值得一提的是，在配体选择性的优化过程中，通过引入自由能微扰计算（free energy perturbation，FEP）对设计化合物进行亲和力预测分析，对于保有5-HT5A活性的化合物进行优先合成，有效地提高了整体效率。最终，经过三轮的构效优化，作者获得了对于5-HT5A亚型受体具有高亲和力（5 nM）和高选择性（>73.5倍）的化合物MS112。
图2 5-HT5A亚型受体选择性配体的优化
（图源：Zhang, S. et al., NSMB, 2022）
综上，该研究针对5-HT5A这一缺少研究的受体亚型在分子和细胞水平进行了较为系统地研究，促进了领域内对该亚型受体的理解。作者通过测定与多种不同类型配体化合物的高分辨率结构，结合丰富的突变体实验，提供了大量分子和细胞层面的功能分析。并且根据结构信息，优化开发了一个高亲和力和选择性的小分子化合物，为该受体的体内功能研究提供了良好的基础。此外，该研究在增加了对5-HT5A受体的认知了解的同时，也为针对缺少研究受体的药物开发研究提供了思路。
然而，文章报道的化合物MS112对于5-HT7亚型受体仍具有400 nM左右的亲和力，相信进一步构效优化会获得选择性更加良好的配体化合物。而且，对于受体功能研究同样非常重要的选择性激动剂配体化合物，在文章中并未提及。此外，课题整体上以体外实验和细胞水平实验为主，未在小鼠体内进行该小分子化合物的药代动力学/药效学（PK/PD）分析，以及缺少据此开展的对于5-HT5A的初步体内功能研究。在此，也希望神经生物学的同行加大对未研究的，或者缺少研究的，但是在大脑中丰富表达的受体进行功能和成药性分析，进一步拓展对于精神类疾病的药物研究。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41594-022-00796-6
课题同时也得到了诸多合作实验室的帮助，其中，西奈山伊坎医学院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）的Jian Jin实验室负责完成了构效分析及化合物合成，加州大学旧金山分校的Brian K. Shoichet实验室负责完成了自由能微扰动计算，南加州大学的Vsevolod Katritch实验室负责完成了对受体热稳定性突变体的预测，北卡教堂山的Jonathan F. Fay实验室则负责完成了电镜数据的收集和处理。此外，相关晶体数据均在阿贡国家实验室的APS光源进行收集分析。最后，Bryan L. Roth实验室负责完成了所有的受体和化合物的药理分析实验，受体蛋白的纯化，结晶，复合物组装，结构解析及参与构效优化分析等工作，并统筹整个课题的进行。对于文章相关内容如有兴趣，疑问或者合作，非常欢迎来信与作者交流（hustzsc@email.unc.edu）。
第一作者：张世成（左）：通讯作者：Jonathan F. Fay（中）、Bryan L. Roth（右）
（照片提供自：Jonathan F. Fay & Bryan L. Roth团队）
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参考文献（上下滑动阅读）
[1] N. M. Barnes et al., International Union of Basic and Clinical Pharmacology. CX. Classification of Receptors for 5-hydroxytryptamine; Pharmacology and Function. Pharmacol. Rev. 73, 310-520 (2021)
[2] M. Yamazaki et al., Functional mechanism of ASP5736, a selective serotonin 5-HT5A receptor antagonist with potential utility for the treatment of cognitive dysfunction in schizophrenia. Eur. Neuropsychopharmacol. 28, 620-629 (2018)
[3] M. Yamazaki, M. Okabe, N. Yamamoto, J. Yarimizu, K. Harada, Novel 5-HT5A receptor antagonists ameliorate scopolamine-induced working memory deficit in mice and reference memory impairment in aged rats. J. Pharmacol. Sci. 127, 362-369 (2015)
[4] M. Yamazaki et al., ASP5736, a novel 5-HT5A receptor antagonist, ameliorates positive symptoms and cognitive impairment in animal models of schizophrenia. Eur. Neuropsychopharmacol. 24, 1698-1708 (2014)
[5] A. Levit Kaplan et al., Structure-Based Design of a Chemical Probe Set for the 5-HT5A Serotonin Receptor. J. Med. Chem. 65, 4201-4217 (2022)
[6] R. H. J. Olsen et al., TRUPATH, an open-source biosensor platform for interrogating the GPCR transducerome. Nat. Chem. Biol. 16, 841-849 (2020)
本文完